Revista de Odontologia da Universidade de São Paulo
versão impressa ISSN 0103-0663
Rev Odontol Univ São Paulo v.13 n.3 São Paulo jul./set. 1999
doi: 10.1590/S0103-06631999000300002
Microbiologia
Anti-Streptococcus mutans IgA in children with and without dental caries
Suzete Cristina YAZAKI*
Cristiane Yumi KOGA-ITO**
Antônio Olavo Cardoso JORGE***
Carmelinda Schmidt UNTERKIRCHER***
YAZAKI, S. C.; KOGA-ITO, C. Y.; JORGE, A. O. C.; UNTERKIRCHER, C. S. IgA anti-Streptococcus mutans em crianças com e sem cárie dentária. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 13, n. 3, p. 211-217, jul./set. 1999.
A cárie dentária é uma doença infecciosa crônica que necessita pelo menos quatro componentes para desenvolver-se: hospedeiro suscetível, microbiota patogênica, dieta rica em sacarose e tempo. Este trabalho estuda as correlações existentes entre estreptococos salivares do grupo mutans, placa bacteriana e anticorpos IgA anti-Streptococcus mutans em crianças com e sem experiência de cárie. Para tanto, utilizou-se o meio Mitis Salivarius (DIFCO) para determinar o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/ml), o Índice de Higiene Oral Simplificado (IHOS) para mensurar a quantidade de placa bacteriana e a técnica ELISA para detectar anticorpos anti-S. mutans. Os resultados obtidos mostraram que não existe uma correlação entre os níveis salivares de estreptococos (UFC/ml) e IgA anti-S. mutans na população estudada. No grupo com cárie, uma correlação positiva, estatisticamente significante, foi observada entre o Índice de placa e IgA específica.
UNITERMOS: Cárie dentária; IgA Anti-S. mutans; Crianças.
INTRODUÇÃO
A cárie dentária é uma doença infecciosa e sua incidência na população adulta e infantil tem sido motivo de preocupação por parte das comunidades científica e governamental13,14,22. A adoção de programas que possam racionalizar os métodos de prevenção e reparação de lesões é importante, principalmente em saúde pública8.
Os principais agentes etiológicos da cárie são os estreptococos do grupo mutans, responsáveis principalmente por lesões em superfícies lisas, seguidos pelos Lactobacillus, Actinomyces e outros gêneros, especialmente envolvidos com lesões em superfícies oclusais14,20,22. O consumo excessivo de carboidratos propicia um meio adequado à proliferação desses microrganismos produtores de ácidos que levam à desmineralização do esmalte3,13,20. Assim, a progressão da doença cárie depende de hospedeiro suscetível, microbiota patogênica e dieta rica em carboidratos, interagindo em condições críticas num determinado período de tempo. Um meio de mensurar em que grau o ambiente bucal favorece a formação de cáries é determinar quantitativamente a microbiota cariogênica individual por meio de testes de risco de cárie. Estes testes são indicadores úteis no monitoramento de programas preventivos cujo sucesso associa-se à redução de cárie3,4,20,22.
Entre os fatores relacionados com o hospedeiro, é importante ressaltar os vários mecanismos antimicrobianos inespecíficos presentes na saliva e os anticorpos IgA, que funcionam como primeira linha de defesa contra diferentes agentes infecciosos9,11,12. A imunidade à cárie pode estar relacionada a anticorpos IgA específicos secretados na saliva, embora os dados existentes na literatura sejam muito contraditórios. ARNOLD et al.5 (1977) verificaram que indivíduos deficientes em IgA têm uma experiência mais alta de cárie que controles normais ou pacientes com deficiência seletiva de IgA, mas com aumento compensatório de IgM anti-S.mutans.
Para GREGORY et al.11 (1990), a resistência à cárie pode ser devida à atividade neutralizante de anticorpos, capazes de inibir crescimento de estreptococos, aderência, produção de ácidos e atividade das enzimas glicosiltransferase e fosfoglicosiltransferase.
A colonização precoce dos dentes por S. mutans é um fator de risco conhecido e que predispõe à cárie na dentição decídua. Tendo em vista esta variável e a resposta de anticorpo anti-S mutans, AALTONEN et al.1 (1990) analisaram, num estudo longitudinal, como a incidência de cárie na gravidez e o íntimo contato mãe/filho, no primeiro ano de vida, pode alterar a experiência de cárie na primeira infância. Crianças, cujas mães tinham uma incidência de cárie acima da média, apresentavam níveis significativamente mais elevados de IgG sérica anti-S mutans. Quanto a IgA, os autores observaram que o grupo de crianças com contagens altas de estreptococos e lesões de cárie tinham concentrações mais elevadas de IgA na saliva, aparentemente sem papel protetor.
Nos últimos anos, acumularam-se evidências de que anticorpos, passivamente transferidos da mãe para a criança, via placenta ou pela amamentação, possam estimular primariamente os linfócitos e assim contribuir para o desenvolvimento da imunidade ativa no neonato12. Este fenômeno deve, portanto, influenciar a resposta de anticorpos para S. mutans nos primeiros anos de vida.
Tendo em vista as controvérsias existentes quanto ao papel de IgA anti-S. mutans na cárie dentária, propusemo-nos a investigar esta relação.
MATERIAL E MÉTODOS
1. População estudada
Participaram deste estudo 52 crianças, sendo 30 do sexo masculino e 22 do feminino, provenientes do Centro de Convivência Infantil Dente de Leite, Éden Lar das Crianças, Casa das Meninas, Casa dos Meninos e Escola de Educação Infantil Melvin Jones, todas instituições localizadas em São José dos Campos, Estado de São Paulo. As crianças foram triadas e divididas de acordo com a presença ou não de lesões de cárie.
Os responsáveis pelos menores foram comunicados de que as amostras de saliva seriam utilizadas para fins de pesquisa e autorizaram a colheita.
1.1. Grupo cárie zero (n = 26) - Composto por crianças sem lesões de cárie. A idade deste grupo variou de 3 a 8 anos (média = 5,46). Quatorze eram do sexo feminino e doze do masculino.
1.2. Grupo cárie ativo (n = 26) - Composto por crianças com uma ou mais lesões de cárie. As crianças foram selecionadas por simples inspeção visual e incluídas neste grupo quando apresentavam lesões evidentes de cárie nas superfícies oclusais. A faixa etária do grupo variou de 3 a 10 anos (média = 5,96). Nove eram do sexo feminino e dezessete do masculino.
2. Exame clínico
As crianças foram examinadas com auxílio de espátula de madeira e espelho clínico e classificadas quanto à presença ou ausência de cárie.
3. Aferição do índice de placa
Os pacientes foram examinados e avaliados segundo o Índice de Higiene Oral Simplificado (IHOS) proposto por GREENE; VERMILLION10 em 1964. Após exame clínico, a saliva foi coletada, por 5 minutos, utilizando-se goma de mascar sem sabor em cálice graduado esterilizado. A seguir, procedeu-se à evidenciação de placa com solução de fucsina básica a 2%.
Após retirar-se uma alíquota de saliva para cultura, acrescentaram-se em cada amostra 20 µl de fluoreto de fenilmetilsulfonil (P7626-SIGMA) 0,5 M e 20 µl de azida sódica a 5% e congelou-se a -20ºC até o uso.
4. Semeadura
A amostra de cada paciente foi diluída em solução salina esterilizada, obtendo-se diluições de 10-1, 10-2, 10-3. Alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram semeadas em placa de Petri no meio Mitis Salivarius Agar (MS-DIFCO) acrescido de 20% de sacarose (DIFCO) e de 0,2 UI/ml de bacitracina (MS-INLAB). As placas foram incubadas a 37ºC por 48 horas, em microaerofilia e as contagens realizadas nas placas que continham de 30 a 300 colônias. A quantificação foi realizada em contador de colônias marca Phoenix modelo EC 550 A.
5. Obtenção do antígeno para a realização do teste ELISA
Utilizou-se a cepa de Streptococcus mutans CCT 1910 (ATCC 35668) estocada em sangue. Uma alíquota de 0,1 ml desta amostra foi cultivada por 24 horas em 8 ml de caldo Brain Heart Infusion (BHI-DIFCO) e incubada por 24 horas a 37ºC, em microaerofilia. Após este período, um inóculo de 3 ml foi transferido para um frasco contendo 100 ml do mesmo meio e a cultura novamente incubada por mais 24 horas a 37ºC, em microaerofilia. No dia seguinte, adicionaram-se os 100 ml obtidos a 4 litros de BHI, distribuídos em frascos de 2.000 ml, que foram incubados a 37ºC, por 48 horas, em microaerofilia. Após esse período, a cultura foi examinada para verificação da pureza, o crescimento interrompido pela adição de 0,8 g de Timerosal (SIGMA) e a cultura guardada em geladeira por 24 horas.
No dia seguinte, as células foram colhidas por centrifugação a 7.000 rpm, por 10 minutos, lavadas 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e uma vez em tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5, EDTA 5 mM e finalmente ressuspensas em 50 ml de Tris-HCl 0,5 M, adicionado de fluoreto de fenilmetilsulfonil 5 mM (P7626-SIGMA). A suspensão celular foi então agitada vigorosamente (50 rpm) com pérolas de vidro por 24 horas a 4ºC. O lisado obtido foi centrifugado 2 vezes a 15.000 rpm por 10 minutos a 4ºC e o sedimento desprezado. O sobrenadante foi dialisado contra água destilada por 24 horas a 4ºC, liofilizado e estocado a -20ºC. A concentração de proteínas por miligrama de peso seco foi determinada pelo método de BRADFORD7 (1976).
6. Técnica ELISA
A técnica ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) foi utilizada para determinar o título de anticorpos IgA anti-S. mutans.
Placas de poliestireno (COSTAR) com 96 orifícios foram sensibilizadas com 50 µl de antígeno de S. mutans na concentração de 100 µg/ml, em tampão carbonato-bicarbonato, 0,1 M, pH 9,6 e incubadas por 2 horas a 37ºC e a 4ºC até o uso. No momento do teste, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS e os sítios livres saturados com PBS-Gelatina a 0,5% por 1 hora a 37ºC. A seguir, as placas foram lavadas mais 2 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween 20 (MERCK) e 50 µl de cada saliva diluída, na razão 2, em PBS-Tween-Gelatina, adicionada aos orifícios em duplicata. Após 2 horas de incubação e nova etapa de lavagem, adicionaram-se 50 µl do conjugado anti-IgA humano, específico para cadeia a, marcado com peroxidase (1µg/ml).
A atividade de peroxidase foi revelada utilizando-se o substrato Ortofenilenodiamino (OPD/SIGMA) 6 mg em 12 ml de tampão citrato/ácido cítrico 0,1M, pH 5,5 e H2O2 a 0,03%. A reação com o substrato desenvolveu-se no período de 30 minutos à temperatura ambiente, sendo então bloqueada pela adição de 50 ml de ácido sulfúrico 2,5 N. As densidades ópticas (DO) foram lidas a 492 nm, em leitor ELISA, marca BIO RAD, modelo 3550.
Os resultados de ELISA foram expressos como título, a recíproca da diluição. Considerou-se título a última diluição de saliva com DO a 492 nm igual ou superior a 0,05.
7. Análise Estatística
A análise estatística foi efetuada para os resultados de contagem de colônias (UFC/ml), placa bacteriana (IHOS) e título de anticorpos. Os coeficientes de correlação foram determinados para as variáveis: índice de placa X IgA, UFC/ml X IgA. Foram utilizados a análise de Variância, o teste de Tukey, o coeficiente de correlação linear de Pearson e ordinal de Spearman.
RESULTADOS
Nas Tabelas 1 e 2, são apresentados os resultados obtidos na contagem de estreptococos do grupo mutans (UFC/ml), do índice de placa e do título de anticorpos nos grupos estudados. O grupo cárie zero (CZ) tinha uma quantidade menor de estreptococos UFC/ml (média = 4,95) quando comparado com as crianças com cárie UFC/ml (média = 5,31) e esta diferença era estatisticamente significante (p < href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-06631999000300002&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt#fig1">Figura 1, pode-se observar que a maioria dos indivíuos do grupo cárie ativo (CA) encontrava-se acima da média do grupo cárie zero. Duas crianças encontravam-se na média e 3 abaixo dela.
A quantidade de placa não diferiu nos 2 grupos estudados (CZ, média = 1,44 e CA, média = 1,36). A Figura 2 mostra o índice de placa na população avaliada. Doze crianças do grupo cárie ativo apresentavam valores inferiores à média do grupo cárie zero e 8 valores superiores. Três crianças encontravam-se na média do grupo cárie zero. Duas apresentavam índices reduzidos de placa e um índice elevado (média + 2DP).
Quanto ao título de anticorpos IgA (Figura 3), não foi possível detectar diferenças estatisticamente significantes (CZ, média = 31,69 e CA, média = 47,62). Dezessete crianças do grupo cárie ativo apresentavam níveis de anticorpos abaixo da média dos controles. Cinco tinham títulos acima da média e quatro apresentavam títulos elevados (média + 2DP). A análise de correlação mostrou que as contagens de estreptococos não se correlacionavam com os títulos de IgA anti-S.mutans, porém no grupo cárie ativo havia uma correlação significante entre o índice de placa e IgA.
DISCUSSÃO
A cárie dentária é um processo que envolve a desmineralização do esmalte dos dentes por ácidos produzidos pelas bactérias da placa dentária a partir dos carboidratos da dieta14,20,22. Em indivíduos, consumindo grandes quantidades de sacarose, a composição da placa modifica-se e seu potencial cariogênico aumenta pelo predomínio de lactobacilos e estreptococos do grupo mutans20.
Uma das formas de estimar o risco de cárie é quantificar os estreptococos e lactobacilos na saliva, pois estes microrganismos associam-se numericamente ao processo de cárie2,4,6,13,14,18,19,22.
Neste trabalho, quantificamos os níveis salivares de estreptococos em crianças pré-escolares, com e sem cárie e correlacionamos estes números com o índice de placa e com IgA anti-S. mutans. Verificamos que 100% das crianças eram positivas para S. mutans. Porcentagem semelhante foi encontrada por AKIYOSHI et al.2 (1998) em 40 crianças de 7 a 8 anos de idade, residentes numa favela da periferia da cidade de Bauru.
Na população total avaliada, apenas 7,6% das crianças com cárie tinham contagens > a 106 UFC. Entretanto, é importante ressaltar que 69,23% do grupo cárie ativo tinham contagens > a 105 UFC e lesões de cárie evidentes. A porcentagem de 7,6% para o grupo total é bem inferior à encontrada por AKIYOSHI et al.2, 1998 (55%). Entretanto, estas contagens estão dentro dos limites considerados por ANDERSON et al.4 (1993) como de alto risco para cárie dentária.
AZEVEDO et al.6 (1998), estudando a prevalência de estreptococos em 50 pares mãe/filho, isolaram esses microrganismos em 47 amostras de saliva de crianças (94,0%). Cerca de 58% das crianças estavam monocolonizadas por S. mutans, 6% albergavam S. sobrinus e 30% as duas espécies de estreptococos. As contagens de estreptococos neste estudo também oscilaram de 105 a 106 UFC.
Analisando o índice de placa no total da população estudada, verificamos que crianças com os mesmos índices de placa apresentavam ou não lesões de cárie dentária. Observação sugestiva de variabilidade no potencial cariogênico da placa dentária. Segundo VAN HOUTE20 (1994), a característica chave na cárie é a alteração produzida pelos carboidratos da dieta na microbiota da placa dentária, levando a um aumento de bactérias acidogênicas que reduzem o pH local e desmineralizam o esmalte.
Vários estudos têm sido feitos numa tentativa de esclarecer se os anticorpos salivares protegem contra a cárie dentária1,2,5,9,11,16,17,21. IgA, na sua forma dimérica, é a imunoglobulina predominante nas secreções externas. Têm amplo espectro de atividade antibacteriana e antiviral e protege as membranas mucosas, impedindo a penetração de microrganismos e agentes estranhos2. A colonização precoce dos dentes decíduos por S. mutans e a ingestão de grandes quantidades deste microrganismo, nos primeiros anos de vida, deve induzir uma resposta de anticorpo específica no soro e na saliva15,17.
Nesta investigação, não encontramos diferenças estatisticamente significantes em IgA anti-S. mutans entre crianças com e sem cárie. Dados similares e que apóiam os nossos foram relatados por outros autores1,2,17. AKIYOSHI et al.2 (1998) quantificaram IgAs na saliva total, não estimulada, de 40 crianças e correlacionaram esses dados com os níveis salivares de estreptococos e lactobacilos. As concentrações de IgAs não diferiam entre os grupos com e sem cárie, nem correlacionavam-se com os níveis salivares de estreptococos. Uma correlação positiva, estatisticamente significante, foi notada entre IgAs e lactobacilos no grupo com CPO-S e ceo-s iguais a zero.
Na opinião de TENOVUO et al.17 (1987), a indução de anticorpos séricos pelos microrganismos ingeridos, em crianças de baixa idade, não impede, muitas vezes, a colonização dos dentes decíduos. Na amostra estudada pelo autor, crianças que tinham permanecido livres de S. mutans apresentavam mais IgG sérica para o microrganismo que crianças cuja dentição decídua estava pesadamente colonizada pela bactéria. IgA salivar anti-S. mutans foi encontrada em 26% das crianças, sem nenhuma correlação com a presença de S. mutans na boca.
Em crianças deficientes em IgA, FERNANDES et al.9 (1995) não encontraram escores mais altos de cárie e placa. Todas tinham níveis mais elevados de IgM anti-S. mutans na saliva que os controles, mas estes níveis não se correlacionavam com as quantidades de S. mutans na saliva, nem com os escores de cárie ou placa. Assim, não foi possível concluir se a baixa incidência de cárie era devida à IgM compensátoria. Resultados que divergem dos nossos foram relatados por outros autores11,16,21.
Numa investigação desenvolvida por GREGORY et al.11 (1990) em indivíduos adultos, os níveis de IgA eram mais altos no grupo cárie-resistente. Resultados similares foram obtidos por ROSE et al.16 (1994) num grupo de 40 crianças. A saliva total, mas não a da parótida, de crianças resistentes continha níveis mais elevados de IgA anti-S. mutans que a de crianças suscetíveis. Estudos recentes, realizados in vitro, também sugeriram um papel protetor para os anticorpos na cárie. Pesquisadores cultivaram S. sobrinus em meio líquido, sobre discos de hidroxiapatita, na presença ou não de anticorpos específicos. Alteração da morfologia das microcolônias e redução em tamanho foi notada com microscopia confocal a laser21.
CONCLUSÕES
É difícil analisar o papel de IgA na cárie dentária. Os dados presentes na literatura são controversos e variam de acordo com a faixa etária estudada, quer se trate de crianças ou adultos. Além disso, a cárie é uma doença complexa que sofre influência de múltiplas variáveis. Os resultados deste trabalho permitem apenas concluir que não existe uma correlação entre os níveis de estreptococos na saliva e IgA anti-S. mutans. Correlação positiva, estatisticamente significante, foi notada entre índice de placa e IgA anti-S. mutans no grupo cárie ativo.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Ivan Baldacci, pela análise estatística, e à FAPESP, pelo suporte financeiro.
YAZAKI, S. C.; KOGA-ITO, C. Y.; JORGE, A. O. C.; UNTERKIRCHER, C. S. Anti-Streptococcus mutans IgA in children with and without dental caries. Rev Odontol Univ São Paulo, v. 13, n. 3, p. 211-217, jul./set. 1999.
Dental caries is a chronic infectious disease that needs at least four components to develop. As a susceptible host, a pathogenic microbiota, a high-sucrose diet and time. This work assess the relationships between Streptococcus mutans and dental plaque; Streptococcus mutans and IgA antibodies in children with and without caries experience. In order to achieve this goal we have used Mitis Salivarius bacitracin agar (DIFCO) to determine the colony forming units (CFU/mL), the simplified oral hygiene index (SOHI) for measuring bacterial plaque and ELISA for antibody detection. The results obtained have not shown any correlations between colony forming units of S. mutans and IgA antibodies. A significant correlation was found between bacterial plaque index and specific IgA in children with carious lesions.
UNITERMS: Dental caries; Children; Anti-S. mutans IgA.
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Recebido para publicação em 27/08/98
Enviado para reformulação em 18/11/98
Aceito para publicação em 16/03/99
* Cirurgiã-dentista.
** Doutora em Biopatologia Bucal - Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP.
*** Professores Adjuntos do Departamento de Patologia da Disciplina de Microbiologia e Imunologia - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP.
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